作者：张毅

      褪黑素是一种生物调制激素，对睡眠、促进性腺发育和生理节奏具有重要作用。低水平的褪黑素已被证明在帕金森病( PD)，失眠、癫痫、缺血性损伤和神经障碍有治疗作用，此外，角色为褪黑激素在白内障的发展，衰老和视网膜炎也被报道。除动物来源外，从90年代开始，人们陆续在许多高等植物中也发现了褪黑素的存在，包括大多数食用植物、部分菊科植物、药用植物以及一些植物种子中也发现了褪黑素的存在，其中药用植物中褪黑素的含量较高。

    研究褪黑素的检测方法，可以鉴定相关天然食品褪黑素的含量，评估相关食品的合理饮食量，同时也可以检测在中草药中也有非法添加的褪黑素。目前非法添加化学物质已成为中药制剂造假的主要方式，例如在镇静安眠类中添加地西泮、艾司唑仑、氯硝西泮、褪黑素等，这属于药品监管部门严厉打击的对象。

    目前，测定褪黑素的方法很多，如高效液相色谱-质谱法( HPLC-MC)、毛细管电泳法(CE)、

气相色谱-质谱法( GC-MS)、荧光法、放射免疫分析法( RIA)、联酶免疫分析法(ELISA)、光检测

法、电泳法、以及电化学法等方法，试验主要对褪黑素的检测方法进行综述。

1  褪黑素检测方法

    进行褪黑素的检测，首先从样品中提取褪黑素。从样品中萃取或提取的褪黑素有多种方法，常用简单方法的萃取溶剂有乙醇、乙酸乙酯、甲醇、10%的Na2CO3磷酸盐缓冲液。为了防止褪黑素在提取过程被氧化，也多采取在提取试剂中添加HC104、EDTA、和抗氧化剂的方法提取。在进行色谱分析之前同样也需要进行前处理，以除去干扰物质，常用液-液萃取( LLE)方法提取褪黑素或者分离杂质，常用的萃取剂除杂，常用氯仿、甲醇等有机溶剂萃取并氮吹蒸干得到纯度高物质。从生物体内或药品中提取后的褪黑素经过前处理可用于分析测定，表1列出几种不同褪黑素的检测方法。

2色谱法

    色谱法( Chromatography)是测定褪黑素的常用方法，检测速度快、精度高，具有检测可靠的特点，但成本高和工作大。常用HPLC-MS, HPLC-FD, HPLC-ECD, LC-MS, GC-MS。

    目前对于褪黑素的检测应用较广为反相液相色谱。开展出液相色谱一三重四极质谱串  联法( LC-MSIMS)检测而啤酒，核桃，西红柿和酸樱桃样品中的褪黑素及其同分异构体，检测下限为9.6～52.9 ng/g或ng/mL; LC-FD检测一系列广泛品种的西红柿和草莓，检测出褪黑素质量浓度范围为0.017～8.8 mg/L; Gonzalez-Gomezc以C18反相液相色谱柱检测不同种类的樱桃褪黑素含量，检测下限为4.3 ng/mL; 用C18反相色谱柱一大气压力化学电离质谱串联检测葡萄皮、红酒和植物中的褪黑素，最低LOD为0.12 pg; 开展出快速液相色谱串联质谱法( LC-MSIMS)检测海鳗中的褪黑素，检测下限( LOD)分别为0.03 ng/mL。研究C18 BEH柱和通过在正离子模式下多反应监测电喷雾的质谱装置执行的检测意大利传统芪葡萄产品中的褪 黑素及其同分异构体。

  3光检测法

    光检测法包括荧光检测法、紫外检测法、发光检测法等方法。常与高效液相色谱( HPLC)串联使用。GB/T 5009.170-2003规定了褪黑素的检测方法，包括荧光检测法和紫外检测法。其中紫外检测法的检出下限为0.5 ng，取样量浓度为0.5 g时，检出质量浓度为0.07 mg/mL;荧光检测法检出下限为30 pg，其线性范围为0.05 ng～0.50 ng。试验主要介绍荧光检测法和紫外检测法。

  3.1荧光测定法

    荧光测定法( Fluorescenee detection，FD)是利用荧光物质吸收特征波长的光后发射荧光，通过测定其荧光强弱来进行定量分析。荧光测定法具有灵敏度高（灵敏度比分光光度法高1～3个数量级），选择性高，线性范围广，以及测定结果与斑点形状无关等优点，常与HPLC或LC等串联使用。Jose发展了双氯仿萃取前处理HPLC-FD法检测鳟鱼的肠道中的褪黑素，以避免在检测不同组织的提取物的干扰，检测下限为8 pg/mL。HPLC-FD可用于检测108种草药中的褪黑素，其中检测出64种中药所含褪黑素超过10 ng/g（干重），其中有39褪黑激素水平超过100 ng/g（干重），10种已经褪黑激素水平超过1 000 ng/g（干重）。Korkmaz探究了280 nm和350 nm的发射波长的荧光检测器检测在不同的生长阶段分析在辣椒植物器官的褪黑激素的含量。

3.2紫外检测法(UV)

    可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，而产生化合物的可见紫外吸收光谱。基于物质对光的选择性吸收的特性而建立分光光度法或称吸收光谱法的分析方法。褪黑素属于吲哚类芳香化合物，具有苯环和含氮杂环，能够吸收紫外光产生和跃迁。对于褪黑素进行UV检测的波长范围从200~223nm，对褪黑激素的检测限从2 mg/L—0.2ug /L。urmeian采用称为“零交叉”技术的二阶或三阶导数紫外光谱分析法检测褪黑素，线性范围是0.5～3.5ug/mL; Amnj等开发出两种简单、快速、灵敏和精 确的紫外检测方法，用邻二氮菲亚铁离子或三价铁离子与2，2-连吡啶分别于pH 4.6或pH 2.5的乙酸钠缓冲液中70℃时对MT衍生化反应10 min，然后分别在=510 nm或522 nm进行UV吸收测定，线性范围分别是0.4～6.4ug /mL和0.4~7.4 ug/mL。

  4电化学分析法

    电化学分析( Electrochemical Analysis)，是仪器分析的重要组成部分之一。它是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质某些量之间的计量关系的基础之上，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。

4.1电泳法

    电泳分析( CE)具有高效率、样品体积小、分析时间短等优点，是一个非常重要的分离技术，特别是对于生物分子。它已经被应用于分离和测定的褪黑激素和相关的吲哚化合物。不同的CE检测方法已经用于测定的褪黑激素、其前体、以及代谢产物。由于这些化合物的电活性，阳极电流检测已成功在该范围内使用的以及获得非常低的褪黑素检测限( 0.3~27 mg/L)。在0.025 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 8.3)12 min的条件中分离检测褪黑素，所使用的工作电极是在一个壁射流配置操作的500-MUM直径碳电极，检出限为1.3×10-6 mol/L;  Ali通过使用熔融石英毛细电泳管( 60 cm×50 mm ID)、磷酸盐缓冲液( 50 mmol/L，pH 3.0)作为背景电解质(BGE)、20 kV的电压施加、UV检测波长214 nm检测褪黑素，其线性范围是10～100ug /L。

4.2传感器检测法

    对于褪黑素的分析，传感器分析具有速度极快、准确度高、前处理要求低、检出下限低等特点。其原理是利用对褪黑素敏感的原件作为检测头，将褪黑素的浓度转换成电信号，从而进行测定。

    利用掺硼金刚石电极，使用循环伏安法检测褪黑素，在罗二氏缓冲剂、pH 3.0、正0.88 V（相对于Ag/AgCl电极）最佳条件下得到伏安响应，检出下限为0.025ug /mL; 利用由多个扫描循环伏安组成的锰六氰基铁酸盐( MnHCF)的混合价的聚（3，4-亚乙基）(PEDOT)的混合膜( MnHCF-PEDOT)玻碳电极检测褪黑素，线性范围较广( 0.1～0.46 nmol/L)，检测下限低(0.01 nmol/L)，响应速度快(3 s)，具有易制备、特异性高、稳定性好和重复性好的优点；在弱酸条件下，以邻苯二胺为功能单体，褪黑素为模板，以电化学聚合物法在铂电极表面合成了性能稳定的褪黑素分子印迹聚合物膜，采用循环伏安法( CV)和差分脉冲法( DPV)对分子印迹传感器的识别性能进行了研究，在1×10-8～1×10-10 mol/L的范围内，褪黑素的浓度与K3Fe(CN)6的相对峰电流变化呈良好的线性关系，检出限( LOD)为1×10-11mol/L。

5免疫分析法

    免疫分析法是利用特定抗体对被检测物质特异性识别结合，通过直接或者间接检测被检物质的方法，具有检测速度快、灵敏度高、成本低等特点。免疫分析法主要有放射免疫测定法和联酶免疫分析法。免疫分析法对于褪黑素的分析目前主要针对动物体内血液。

5.1放射免疫测定

    放射免疫测定( Radioimmunoassay，RIA)是利用放射性核素的测量方法与免疫反应的基本原理相结合的一种放射性核素体外检测法。该法有灵敏度高、特异性强、精确度佳及样品用量少等优点，因而发展迅速，但由于这种方法具有放射性元素，故在食品检测领域中的应用未见报道。

    通过用标记褪黑素单克隆抗体进行交叉反应测试，除与N-乙酰血清素一个0.81%交叉反应外，几乎没有与其他物质进行交叉反应，线性检测范围是50 pg～100 ng; 褪黑素标记物作为示踪剂进行抗血清的特异性分析，线性范围是0.022~0.345pmol/药瓶；褪黑素检测昆虫血液中褪黑素的含量，检测下限为40 pg/mL; 褪黑素和多克隆兔抗褪黑素血清结合的方法，测定鸡血液和松果体中的褪黑素含量；褪黑素与高亲和力特异性抗羊血清抗体结合，检测各种动物中松果体褪黑素含量，检测下限为0.005 pmol/ mL，分别获得大鼠、仓鼠、绵羊和龟松果体匀浆平行抑制曲线。

5.2联酶免疫分析法(ELISA)

    酶联免疫吸附测定( Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。ELISA包括竞争法、双抗体夹心法、抑制性测定法、间接性测定法等方法。

    设计用单克隆抗体ash-10对褪黑素进行ELISA检测，方法为高碘酸氧化法辣根过氧化物酶( HRP)标记的直接竞争的ELISA方法，为提高灵敏度，褪黑素与碱性磷酸酶共轭，检测下限为100 ng/mL; 褪黑素与牛血清白蛋白( BSA)进行偶合，注入Balb/c小鼠腹腔内进行免疫，其脾细胞产生抗体的高效价融合与SP2/0骨髓瘤起源细胞，制备两种稳定单克隆AS-H10和AS-D26，构建出一个广泛的线性检测范围(10 ng/mL～10 g/mL)；甲醛将褪黑素和牛血清蛋白进行偶合，用多焦点真皮内注射免疫Balb/c小鼠，通过PEG诱导的融合的免疫PLN和SP2/0细胞选择了阳性细胞株和所确定的单克隆抗体对MT的效价，获得5株能分泌高特异性抗体的杂交瘤细胞，用于ELISA检测。

6结语与展望

    随着我国经济发展和国民生活水平提高，群众对健康生活和保健食品的需求也日益增加。自然界中许多动植物都含有褪黑素，由于对于动植物中的褪黑素含量了解甚少，因此不能评估合理有效的进食量。同时，褪黑素类产品已经在国外广泛应用，几年来我国也开始大量开发生产该类产品。为达到保证褪黑素类产品的质量、保护消费者身体健康的目的，必须发展褪黑素的检测方法。

目前对于褪黑素检测多数是采用仪器分析法，当中高效液相色谱法( HPLC)最为普遍。仪器分析法具有灵敏度高，回收率高，线性范围好，准确度高的优点。但由于仪器检测前需要进行复杂的前处理以及高成本等因素，一定程度上限制了褪黑素的检测。对于ELISA和电化学传感器这些快速检测方法，优点在于前处理要求相对较低，速度快，但多数是针对人体血液或其他动物器官中的褪黑素检测，专门针对食品基质中褪黑素检测的检测方法较少。因此发展电化学传感器、RIA、ELISA等快速检测方法来进行食品中褪黑素的检测是未来对于褪黑素检测发展的趋势。

7摘要

褪黑素作为一种主要是由哺乳动物和人类的松果体产生的一种胺类激素，具有安眠、抗衰老、抗肿瘤等作用，常作为辅助睡眠保健食品的功能因子之一，西红柿、葡萄等食物中也含有褪黑素。研究褪黑素的检测方法，可以鉴定相关天然食品褪黑素的含量，评估相关食品的合理饮食量，也可鉴定保健食品中褪黑素含量是否超标或不达标以及中草药中非法的褪黑素。因此对褪黑素的检测具有重要意义。对褪黑素的来源和功能做简单介绍，重点对褪黑素的检测方法研究进展进行了综述。