作者：郑晓敏

    大量研究表明，预处理所产生的抑制物质会影响酵母的正常生长和后续的发酵过程。因而，研究预处理后水解液中的抑制物组成成分，并寻找有效的脱毒方式，对于进一步提升木质纤维素降解率和生物乙醇产率具有重要意义。

    目前，人们对不同原料在各类预处理方法与条件下所产生的抑制物已有广泛研究，但主要集中在稀酸、蒸汽爆破、碳酸钠一氧化水解等预处理手段。例如，Larsson等用稀硫酸在高温蒸汽下水解云杉，发现主要水解液中的主要抑制物为乙酸、甲酸、乙酰丙酸、糠醛和羟甲基糠醛等；Martin等用蒸汽爆破一酶解法处理甘蔗渣，发现乙酸、甲酸、糠醛、羟甲基糠醛、酚类化合物等为主要抑制物；Klinke等[8]用碳酸钠一氧化水解法水解麦草，结果表明乙酸、甲酸、羟基乙酸、苹果酸、酚类化合物等为主要抑制物。然而，关于氢氧化钠预处理对木质纤维素水解液中抑制物组成成分的影响和水解液中主要抑制物的研究少有报道。

    本课题组前期研究结果表明，氢氧化钠预处理是一种较为有效的稻草秸秆生产燃料乙醇过程中的预处理手段，其最优预处理条件为：NaOH浓度为2%( w/w)，温度为85℃时处理l h。文章采用萃取浓缩一气相色谱质谱联用技术(EE-GCfMS)，对经最优条件下碱预处理后和未经碱预处理的稻草秸秆水解液中的抑制物组成成分进行了初步研究，并分析了主要抑制物的抑制机理和抑制作用，可为针对性消除碱预处理时产生的有毒抑制物对后续酵母发酵产燃料乙醇的不良影响提供一定的科学依据。

  1实验部分

  1.1材料与方法

  1.1.1稻秸原料的采集

    稻草秸秆于2013年10月采自上海市闵行区吴泾镇的农田。带回实验室用清水洗净3遍，去除秆节，烘干后备用。

  1.1.2稻草秸秆水解液的制备

    用粉碎机将稻秸粉碎，并过40'目筛，取所得样品10 g于具塞三角烧瓶中；添加100 mL 2%(w/w)氢氧化钠溶液于该烧瓶中，85℃水浴加热处理样品th，室温冷却静置20 min。添加等量纯水的空白样作为对照组。

  1.1.3稻草秸秆水解液的萃取浓缩

    取静置后上层溶液40 mL，在Thermo冷冻离心机上在25℃（室温）温度条件下以4 500 r/min离心5mm;取离心后清液30 mL于分液漏斗中，在各分液漏斗中分别加1.5 mol/L的硫酸溶液将其pH调至2左右，以使酚钠盐成为酚类物质，再分别加入7.5 g硫酸铵（提高萃取率）、20 mL二氯甲烷，振荡萃取10 min，静置10 min;取下层萃取液15 mL于离心机上原速离心5 min;取10 mL离心后清液于试管中，加入等量的硫酸溶液进行酸洗；取下层酸洗后的清液8 mL于40℃下蒸发浓缩30 min左右至0.5 mL，用于Agilent7890A气质联用仪(GC-MS)的进样测定。

1.2 GC-MS分析

1.2.1  GC条件

    色谱柱：HP-5MS(30 mx0.25 mmx0.25 μm)弹性石英毛细管柱；载气：He(99.999%)；恒流，柱流量：1.0mL/min；分流模式：不分流；进样量：1.0μL;进样口温度：250℃；柱始温60℃，保留0 min，程序升温以8℃/min升至180℃，保持2min，程序升温以7℃／min升至250℃，保持2 min;辅助加热区2打开，初始温度280℃，方法总运行时间为29 min。

1.2.2质谱条件

    离子源：EI源；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；色谱一质谱连接口温度：280℃；电子能量：70eV;电子倍增器电压l 500 V;溶剂延迟时间：4 min;扫描方式：全扫描，扫描质量数范围是：35～400，阈值为200。

2结果与讨论

    文章依据Palmqvist、Larsson、Heer、Klinke、Rasmussen等的研究基础与分类标准进行分类，将主要由木质素降解产生的带有酚结构的物质统称为酚类，其中又可依据所含官能团分为酚醛、酚酮、酚酸等，将主要来自于纤维质的脂肪酸等简称为酸类，将主要来自于纤维质的呋喃衍生物（酸处理时为呋喃醛）称为呋喃类，其它物质根据各自官能团进行分类。

2.1碱预处理前后稻草秸秆水解液中抑制物组成成

分分析

    对照组和经过2%氢氧化钠预处理的稻草秸秆水解液的总离子流色谱图分别如图1和图2所示。每个浓度组设置3个平行实验，每个平行样进3针，图库检索时每组去除非重复9次出现的几种物质。根据NIST11质谱数据库检索，对两组水解液中的抑制物组成成分进行鉴定，应用峰面积归一法确定各自的相对含量，分别如表l和表2所示，表中的保留时间指的是出峰时间，匹配度反应的是每个峰的离子图和NIST11图库中检索到的已知标准物离子图的相似度，匹配度达到80%即较为可信，每组匹配度选择9个数据中的最小值；相对含量为每种物质对应峰积分面积占总积分面积的百分比，表中取9个相对含量数据的平均值；标准差是以上9个相对含量数据的标准差。每组的平行实验数据显示：不超过3种物质在图库检索时非重复出现，各平行实验中物质保留时间相差小于0.2 min，大部分物质相对含量的标准差较小，各组平行实验数据间不存在显著差异。

2 .1.1对照组稻草秸秆水解液中抑制物组成成分

    共鉴定出对照组稻秸水解液中的23种抑制物，它们可以分为8个类别。包括酚类化合物3种，按相对含量排列分别为：香草醛>2，4-二叔丁基苯酚>丁香醛；酸类化合物4种，分别为：十六烷酸(占大部分：14.90%)>己酸>苯甲酸>十八烷酸(0.92%)；酮类化合物5种，分别为：4-羟基-3，5，5-三甲基-4-( 3-酮-1-丁烯基）-2-环己烯-1-酮>3-甲基-4-乙烯基-1H-吡咯-2，5-二酮>植酮>4-(2，6，6-三甲基-1，3-环己二烯-1-基)-3-丁烯-2 -酮>大马士酮(0.90%)；烷烃类化合物3种，分别为：正二十四烷（占大部分：29.89%）>正二十烷>正十九烷(0.59%)；呋喃类化合物4种，分别为：二氢猕猴桃内酯>2，3-二氢-2-甲基苯并呋喃>丙位己内酯>丙位戊内酯，后面2种低于1%；酰胺类化合物1种，为N-丁基苯磺酰胺(4.58%)；萘类化合物1种，为1，2，3，4-四氢一l，l，6-三甲基萘(0.64%)；此外还有酯类化合物2种，分别为：邻苯二甲酸二丁酯（占大部分：4.73%）>磷酸三丁酯(0.69%)。

2 .1.2经过2%氢氧化钠预处理的稻草秸秆水解液中抑制物组成成分

    共鉴定出经碱预处理稻草秸秆水解液中的30种抑制物，它们可以分为6个类别。包括酚类化合物10种，按相对含量排列分别为：阿魏酸（占大部分：43.79%）>香草醛>乙酰丁香酮>2-甲氧基-4-乙烯基苯酚>丁香醛>对羟基苯甲醛>香草乙酮>2，4--叔丁基苯酚>4-乙基间苯二酚=水杨酸(0.1%)，后4种均低于1%；酸类化合物8种，分别为：十六烷酸（占大部分：18.13%）>亚麻酸>亚油酸>十八烷酸>苯甲酸>十七烷酸>十五烷酸>十四烷酸，后面2种低于1%；酮类化合物8种，其中巨豆三烯酮（占大部分：2.71%）>甲基环戊烯醇酮>植酮>大马士酮>2，5-己二酮>3-甲基-2-环戊烯-1-酮>乙基环戊烯醇酮=环戊烷-1，2-二酮(0.09%)，后面7种均低于1%；呋喃类化合物1种，为二氢猕猴桃内酯(0.37%)；酰胺类化合物2种，分别为：双五亚甲基尿素>油酸酰胺，均低于1%；萘类化合物1种，为l，2，3，4-四氢-1，1，6-三甲基萘(0.15%)。以上对于相对含量低于1%的物质都有标明。

2.2碱预处理前后稻草秸秆水解液中抑制物按类别的组成成分对比及抑制作用分析

    由于水解液中物质的复杂性，确定其中抑制物总质量和各个成分的质量存在很大困难，但可以借助各个处理组总离子流图的总积分面积来近似描述抑制物总量，结合总离子流图1、2中的物质峰高和对照组总积分面积：( 3.97x108+3.90xl07)及碱预处理组总积分面积：( 6.07xl09+5.92xl08)，可知碱预处理组水解液中的总抑制物量是远多于对照组的，而且每个处理组的各平行实验数据之间不存在显著差异：碱预处理前后稻秸水解液中抑制物经分类后的相对含量对比情况如图3所示，从图3可以看出：碱预处理前后水解液中抑制物组成成分有着极大地变化，对照组的水解液中各类别物质相对含量分布更均匀，按相对含量排列分别为：烷烃类>酸类>酮类>酚类>呋喃类>酯类>酰胺类>萘类；经过碱预处理的水解液中酚类和酸类物质占据94.46%的总相对含量，成为最主要的抑制物，而其它类别物质的相对含量相比对照组均大幅降低，其中各类物质按相对含量排列分别为：酚类>酸类>酮类>酰胺类>呋喃类>萘类，烷烃类和酯类物质未检测出；出现上述变化的主要原因可能是：NaOH溶液削弱纤维素和半纤维素间的氢键，引起木质素和半纤维素间的酯键发生皂化，破坏本质素结构，进而使得部分木质素与纤维质分解生成酚类和酸类物质。下文结合表1与表2对水解液中各类抑制物的抑制作用进行分析。

2.2.1酚类化合物

    酚类化合物的抑制作用很强，小分子量的酚类化合抑制作用最强。酚类化合物能渗透到细胞膜内，破坏细胞的完整性和活性，影响发酵微生物的正常生长，甚至导致死亡。经研究发现，酚单体上的脂肪族官能团取代基对酒精形成的抑制作用很明显；而酮基、醛基、羧基等大部分取代基都加大其抑制作用。

    本研究中，经过碱预处理的稻秸水解液中酚类物质种类相比对照组从原来的3种增加到10种，经过碱预处理后新出现了7种对照组未检出的酚类物质，总相对含量相比对照组显著增加，从原来的10.87%增长至64.03%，增长率达489.05%．3种共有酚类物质对比后发现丁香醛（减少率为10.5%）和2，4-二叔丁基苯酚（减少率为92.9%）减少，而香草醛却有所增加（增长率为10.8%）；新出现7种酚类物质中又以阿魏酸(43.79%)占主要组分，其次是乙酰丁香酮(6.63%)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3.14%)。从以上酚类物质的结构可以看出，它们都含有酮基、醛基、羧基等官能团，这些都很可能加大酚类物质对后续酒精发酵过程中酵母等的抑制作用。

2.2.2酸类化合物

    酸类物质在发酵过程中对微生物的抑制作用主要表现在：有机酸分子以简单扩散的方式穿过细胞膜进入微生物细胞中，使细胞内环境酸化，消耗并透支ATP从而抑制细胞生长；Zaldivar等发现酸类对菌体生长的抑制作用随pH的升高而减弱，并且酸类疏水性强则其抑制作用也强。

    本研究中，检测出的酸类除苯甲酸外均为脂肪酸，而经过碱预处理的稻秸水解液中酸类物质相对含量比对照组有所增加，从原来的21.04%增加到30.43%,增长率为44.6%。酸类物质从原来的4种增长到8种，其中3种是共有的酸类物质，3种酸类物质中十六烷酸（增长率为21.7%）和十八烷酸（增长率为120.7%）相对含量增加，而苯甲酸却有所减少（减少率为31.8%）；经过碱预处理的水解液中新增5种酸类物质，其中以亚麻酸(3.86%)和亚油酸(2.53%)占多数。但对照组的己酸(2.67%)在经碱预处理后的水解液中未检测出。十六（八）烷酸、亚麻酸、亚油酸等疏水性强，结合它们较大的相对含量可知：经过碱预处理的稻秸水解液中酸类物质的抑制作用是相当大的。

2.2.3其它类物质

    经过碱预处理的水解液中除以上两大类物质之外，酮类、烷烃类、呋喃类、酰胺类、萘类、酯类等物质的含量及抑制作用均较弱。

    本研究中的酮类均为脂肪酮或脂环酮，经过碱预处理的稻秸水解液中酮类（8种共4.31%）相比对照组（5种共18.54%）大幅下降，减少率为330.2%。烷烃类物质毒性相对较小，碱预处理后的水解液中未检测出烷烃类物质。水解液中的呋喃类物质主要为呋喃酯类，其毒性较低，相对含量从6.95%下降到0.37%。部分酰胺类虽具有抗生素的作用，但是考虑到酰胺类物质可能产生于硫酸铵，而且相对含量从对照组的4.58%降到经过碱预处理的0.7%，因而其毒性作用不深人探究。萘类和酯类相对含量分别从0.64%和5.42%降至0.15%和0%，可见，这两类物质的抑制作用在经碱预处理后均较低。

3结论

    (1)经过碱预处理的水解液中检测出的抑制物为6类30种，对照组为8类23种；经过碱预处理后抑制物种类增多，但集中于少数几类物质，对照组抑制物种类少但较为分散。

    (2)经过碱预处理的水解液中酚类和酸类物质种类比对照组明显变多，酚类物质种类从3种增加到10种，酸类物质种类从4种增加到8种；相对含量相比对照组显著增加，分别从10.87%及21.04%增长至64.03%及30.43%，同时由于这2类物质相对大的毒性，使得它们成为最优处理条件下的水解液中的主要抑制物。因而，对于酚类和酸类物质的去除是稻草秸秆生产燃料乙醇工艺中消除发酵抑制作用的关键。其中，酚类中的阿魏酸(43.79%)和酸类中的十六烷酸(18.13%)

含量最高，应考虑重点去除。其次，应该考虑去除的可能有乙酰丁香酮(6.63%)、2-甲氧基-4乙烯基苯酚(3.14%)、亚麻酸(3.86%)和亚油酸(2.53%)和巨豆三烯酮(2.71%)等。

(3)2% NaOH碱预处理对于稻秸水解液中抑制物组成成分和抑制作用产生了极大的影响，从总抑制物量、酚类和酸类的相对含量以及它们的毒性等综合看来，其水解液中抑制物总抑制作用很可能强于对照组。  

4 摘要：

采用萃取浓缩一气相色谱/质谱联用技术( EE-GC/MS)对未经碱预处理与经过2% NaOH碱预处理的稻草秸秆水解液中抑制物组成成分进行了研究，旨在为解决碱预处理对木质纤维素原料生产燃料乙醇过程的抑制作用提供理论支持。研究结果表明，经过碱预处理的稻秸水解液中检测出抑制物种类共6类30种，对照组共8类23种。其中，经过碱预处理的水解液中酚类和酸类物质种类比对照组明显增多，酚类物质种类从3种增加到10种，酸类物质种类从4种增加到8种；相对含量亦比对照组显著增加，酚类物质的相对含量从10.87%增长至64.03%，酸类物质的相对含量从21.04%增加到30.43%，成为最优碱预处理条件下的水解液中的主要抑制物，其中阿魏酸和十六烷酸相对含量最高，分别为43.79%及18 .13%；此外，其它类别的物质相对含量均大幅降低。综合看来，经过碱预处理的水解液中抑制物总抑制作用强于对照组。